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高压均质法制备植物精油包裹脂质体

作者:www.willnano.com 日期:2021-08-29 点击:343
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植物精油,字面上看,源于植物,源于自然,是从植物中提取出来的具有高植物芳香和高挥发性的物质。植物精油多为短链分子复合物,易渗透皮肤,植物精油在护肤产品、奢侈品、医疗辅助产品、功能食品添加剂等领域都有不可替代的作用。自然界中植物产生精油,用来吸引传粉者、化感竞争、防御昆虫和其他动物、抗真菌抗细菌来保护植物。不同植物来源的植物精油具有不同的效果,例如,橙花精油具有缓解皮肤紧张状态,促进皮肤再生,防止皮肤老化的功效,可以改善皮肤干燥问题;香茅精油能够缩小毛孔,改善青春痘,头发出油等问题;玫瑰精油能够缓解压力,解决失眠问题,适用于混合型皮质,具有镇静效果;迷迭香精油能够清洁、紧致肌肤,有效消肿···

脂质体是一种磷脂双分子层结构,脂质分子的双亲性,脂质分子在水中可以依据相似相溶的原理自发形成同时含有水相和油相的脂质体体系,脂质体具备既能包封亲水药物又能包封疏水药物的能力。脂质体作为一种药物递送载体,具有以下几个特性:①改变物质的物理形态,便于物质的贮存和运输;②采用不同的形式,控制活性物质的释放;③保护芯材不受或少受环境的影响,提高芯材的稳定性能;④掩蔽某些物质的不良气味,改善物质的使用性;⑤控制药物的靶向化,降低毒副作用。除此之外,脂质体还具备水分散性好、生物利用度高、生物相容性强和生物可降解性等特点。总的来看,脂质体与其他剂型相比,具有两亲性,可包封的物质种类多且不改变其生理活性,是比较理想的包埋载体。随着远程载药、触发释放、靶向配体、药物组合等技术的开发,脂质体的应用越来越广泛。并且脂质体粒径范围从几十纳米至数微米,可以通过改变脂质体的粒径大小,表面电荷等性质来提高其应用范围。

脂质体磷脂双分子层结构示意

图1 脂质体磷脂双分子层结构示意

 脂质体包裹植物精油的原由,以植物源抑菌功能为例:水果果实采后腐烂问题已引起世界范围内的极大关注。营养丰富的水果是人们日常生活的必备品,但众多浆果类水果在采后贮藏运输过程中由于微生物侵染而造成的病害,严重影响了采后保藏,导致大量的经济损失。而传统的化学抑菌剂由于毒性较大、结构稳定、不易降解造成药物残留、污染环境、耐药性、危害人体健康等毒副作用而不被人们所接受,因此寻找残留量低、环境友好、高效和低毒的抑菌替代物就日渐迫切。近年来,天然植物源性抑菌剂的研究备受重视,而植物精油作为一种具有良好性能的天然抑菌剂更是受到国内外学者的广泛关注。在已发现的植物精油中,柠檬醛是一种GRAS物质,含有新鲜柠檬样香气且具有较好的抑菌活性。但其本身存在一些问题函待解决,由于一系列环化和氧化反应,柠檬醛在低pH值的含氧环境中储存期间会发生化学降解。这些反应减弱了柠檬醛的有效作用,并产生异味化合物。此外,由于柠檬醛是疏水的,其应用受到其在水中的低溶解度的限制。一些研究人员利用脂质体包埋技术最大限度保留植物精油的功能活性,拓展了植物精油在食品领域的应用。例如,肉桂醛是肉桂精油的主要成分,其包裹在脂质体后抑菌活性仍然显著,推动了肉桂醛脂质体作为高效防腐剂和保护剂在食品防腐中的应用。精油分子中一般含有不饱和键,容易受外界环境因素的影响而分解,而经过大豆卵磷脂包封之后的豆蔻精油脂质体对肉类食品具有较好的保护作用。采用薄膜水化法辅助超声波技术制备的茶树精油脂质体改善了茶树精油水溶性差、室温空气中不稳定的缺点。采用薄膜分散法制备咖喱植物精油脂质体并将其应用于水稻中,脂质体表现出对蜡状芽孢杆菌优异的抑菌性;将牛至油中的主要活性成分百里香酚进行包埋并添加于可食用膜中,有效延缓了精油的释放率并提高了抑菌持久力。为了解决柠檬醛的应用问题,本实验采用水分散性好、生物利用度高、生物相容性强和生物可降解的药物传递载体脂质体来改善柠檬醛的制备与应用形式。

本实验以柠檬醛为脂相包埋药物,基于安全无毒方面考虑选用大豆卵磷脂、胆固醇为脂质壁材,采用薄膜分散法结合高压微射流均质技术制备出柠檬醛脂质体。对柠檬醛脂质体的微观形貌、粒径分布、表面电位、包封率等进行表征;考察了柠檬醛脂质体的缓释特性和储藏稳定性。

 

柠檬醛脂质体的制备

主要实验设备:

旋转蒸发仪RE-5299上海亚荣

超高压均质机NanoDeBEE30苏州微流纳米

DLS粒度分析仪英国MalvernInstrumentsLtd.

 NanoDeBEE 超高压均质机

图2 NanoDeBEE 超高压均质机

 

根据柠檬醛的性质采用应用最为广泛的薄膜分散法制备柠檬醛脂质体,并通过高压微射流进行粒径与包封控制。

具体操作如下:

用天平精确称量处方量的大豆卵磷脂,胆固醇,柠檬醛,使质量比为3:1:1.5于250mL圆底烧瓶中,加入适量无水乙醇,以40KHz冰水浴超声10分钟,使三者充分混匀。

然后用旋转蒸发仪将有机试剂旋转真空蒸发,在圆底烧瓶内壁形成一层均匀的脂质薄膜,调节水浴温度为50°C,真空度为0.1MPa,转速为40r/min。待旋转蒸发完成之后将其置于通风橱中真空干燥过夜以除去残留的有机溶剂。

把适量的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.0)倒入干燥好的含有脂质薄膜的圆底烧瓶中进行水化,在常压下以转速60r/min进行旋转以使脂质薄膜剥落。

再将其置于超声波清洗器中冰水浴超声,直至脂质薄膜完全碎裂形成粗脂质体混悬液。将粗脂质体混悬液置于微波催化合成萃取仪中,在冰水浴条件下使用探头超声10分钟(频率设置为超声1s,停2s以防止探头超声产生的热量破坏脂质体,然后将混悬液在10,000psi的压力下通过高压微射流均质仪进行2个循环,以控制粒径与增加包封率。

最后,进行透析步骤以完成脂质体加工,通过截留分子量为8-10kDa的纤维素酯透析袋所得悬浮液以除去未包封的柠檬醛,制得柠檬醛脂质体悬浮液。

另外,按照上述方法制备不含柠檬醛的空白脂质体。

 

实验结果:

柠檬醛脂质体形态表征

 柠檬醛脂质体的外观状态

图3 柠檬醛脂质体的外观状态


图3为所制得的柠檬醛脂质体悬浮液外观形态,呈半透明状,具有均一淡蓝色乳光的胶体状态,符合脂质体的一般特性,证明制备的脂质体状态良好。经过磷钨酸染色后在透射电镜下观察到的微观形貌图,如图4所示。脂质体呈近似球形囊泡状,与前人报道的脂质体形态相吻合,且大部分脂质体直径在80nm至150nm之间,脂质体大小较为均匀。

 柠檬醛脂质体在不同放大倍数下的透射电子显微镜图像

图4 柠檬醛脂质体在不同放大倍数下的透射电子显微镜图像:(a)×150000;(b)×750000

 

柠檬醛脂质体粒径和Zeta电位的测量

柠檬醛脂质体与空白脂质体的粒径电位

表1 柠檬醛脂质体与空白脂质体的粒径电位


由表中数据可以看出,通过DLS测得的脂质体平均粒径在105.7nm左右,这和透射电镜观察到的结果一致。柠檬醛脂质体比空脂质体的粒径(117.7±1.53nm)要小,这说明柠檬醛的加入可能能够减小脂质体粒径的大小,当柠檬醛与脂质体膜表面接触后,改变了脂质体膜的强度,增加了脂质流动性,而制备过程中的超声作用能够使脂质更容易分散,造成粒径减小。另外,柠檬醛能使脂质囊泡内的非极性键之间形成更高的聚合力,使大豆卵磷脂囊泡的表面曲率增加。PDI即多分散指数,表示脂质体直径的多分散性。PDI越大,说明脂质体直径分布越宽,越不均匀;PDI越小,则说明脂质体直径分布越集中、均匀。一般来说,体系的PDI数值小于0.3表明该体系具有均匀的分散性。本实验制备的柠檬醛脂质体PDI均在0.23左右,证明所制得的柠檬醛脂质体具有较好的分散性,脂质体粒径分散较为均匀。

Zeta电位是表征脂质体包封体系稳定性的重要参数。较高的Zeta电位会在分散粒子之间产生排斥力,从而增加胶囊的稳定性;反之,Zeta电位越低,胶囊粒子越倾向聚集。通常,认为Zeta电位<-30mV或>+30mV为高电位,则表示胶体分散体系具有较好的稳定性。测得柠檬醛脂质体的Zeta电位为-43.2±0.11mV,表明所制脂质体具有良好的稳定性,不易发生凝聚现象。柠檬醛脂质体的Zeta电位为负值主要是因为所使用的脂质体壁材大豆卵磷脂末端存在带负电荷的羟基所导致的。而柠檬醛脂质体与空白脂质体Zeta电位的差异显然是柠檬醛在脂质膜中堆积造成的,因为柠檬醛本身为弱极性、不带电荷的脂溶性小分子,溶解或插入脂质膜内,占据了磷脂的位置,导致脂质体表面电荷密度下降。

 

包封率及保留率的测定

 柠檬醛脂质体的包封率

表2 柠檬醛脂质体的包封率


作为食品领域理想的包埋体系往往以高载量和高包封率为目标,并且高包封率也是脂质体充分发挥优势,比普通制剂更加高效、低毒的关键。由表可知,在本实验选取的制备脂质体条件下,3次重复实验的包封率均在60%以上,并且3次实验无显著差异(p>0.05),说明重复性好,所选的工艺条件是可行的。

 柠檬醛脂质体与游离柠檬醛在室温下不同放置时间的保留率

图5 柠檬醛脂质体与游离柠檬醛在室温下不同放置时间的保留率

 

经过脂质体包裹后,是否具有缓释效果是判断该脂质体能否发挥其长效性的关键。柠檬醛脂质体和游离柠檬醛于室温下储存3周的保留率变化曲线如图5所示。两种体系中柠檬醛的保留率表现出了很大的差异,游离柠檬醛的保留率下降幅度大,在室温下贮存1周后其体系中柠檬醛的保留率几乎降至为0,再一次佐证了柠檬醛在空气中易挥发不稳定的特点;而柠檬醛脂质体中柠檬醛的保留率虽然也表现为下降趋势,但在室温下贮存3周后仍然保留初始柠檬醛含量的20%左右且下降速率较为缓慢。可以看出,未经包裹的柠檬醛挥发较快,而经过脂质体包封之后的柠檬醛其释放速度大幅减缓,持续挥发量明显减少,说明脂质体能够延长柠檬醛的保留时间,具有一定持续释放的能力,较好地阻止了柠檬醛的损失。

 

柠檬醛脂质体储存稳定性的考察

柠檬醛脂质体在室温下放置不同时间的粒径与Zeta电位变化情况

图6 柠檬醛脂质体在室温下放置不同时间的粒径与Zeta电位变化情况


脂质体是一种热力学不稳定的动态膜,脂质分子之间能不断运动交换位置,在贮存过程中会自发产生聚集、融合、絮凝等失稳现象,导致脂质体结构不稳定。如图6所示,柠檬醛脂质体在室温下储存3周后,其平均粒径从最初的105.7±2.08增加至238.0±29.82nm,并且随着时间的变化,脂质体平均粒径的变化程度略高。说明了脂质体颗粒发生了聚集融合,囊泡的聚集了导致粒径的增加,但脂质体平均粒径的增加主要集中在前3周,此后粒径继续增加的趋势不如前期明显(未在图片中显示)。而随着储存时间的延长,Zeta电位从高负值(-43.2mV)降低为中等负值(-25.4mV),这主要由于构成柠檬醛脂质体壁材的主要成分为大豆卵磷脂,其末端的羟基带负电荷,而其分子中含有不饱和的脂肪酸链,易与空气中的氧气发生反应并进一步水解成甘油磷酸复合物及脂肪酸,使体系中负电荷总量下降;另一方面,大豆卵磷脂的氧化水解会增加膜的流动性,致使包封的柠檬醛渗漏,导致脂质体溶液中的离子强度增大,而离子强度增大到一定程度时所引起的静电屏蔽效应会使得脂质体表面电荷密度降低。总的来说,本实验所制备的柠檬醛脂质体在室温下储存的平均粒径及Zeta电位变化符合脂质体的一般规律,且变化趋势在较稳定的范围内,更重要的是现制的脂质体符合良好稳定性的特征(平均粒径、PDI及Zeta电位)。因此,可以认为现制备的柠檬醛脂质体具有较好的稳定性。此外,脂质体较好的储藏稳定性还可以从其照片直观地观察到,于室温下放置1个月后仍然澄清均一,无油滴溶出亦无沉降现象(图7)。当然,脂质体长期存放还是需要注意的,可以通过密封放置在较低的温度下来提高脂质体的稳定性。

 柠檬醛脂质体在室温下放置一个月的外观状态A:放置前的柠檬醛脂质体;B:放置一个月后的柠檬醛脂质体

图7 柠檬醛脂质体在室温下放置一个月的外观状态A:放置前的柠檬醛脂质体;B:放置一个月后的柠檬醛脂质体

 

总结:本实验通过薄膜分散法结合高压微射流均质成功制备了柠檬醛脂质体,并对其进行了外观形态表征。结果显示,制备得到的柠檬醛脂质体呈近似球形囊泡状,平均粒径为105.7±2.08nm,PDI为0.236±0.010小于0.3,均一性良好并且具有较高的包封率(61.75±1.58%)。而保留率结果显示,包封之后的柠檬醛脂质体在室温下贮存3周后仍然保留初始柠檬醛含量的20%左右,能够克服精油易挥发的缺点,达到长效释放的效果。稳定性考察显示制备的柠檬醛脂质体在室温条件下避光放置1个月,无絮凝沉降现象,高负Zeta电位(-43.2mV)也间接证明了其具备较好的稳定性。

 

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