一些具有调节血脂、预防心脑血管等功能的活性物被广泛应用医药和保健品行业。但是具有这些功能的活性物常常具有高度的不饱和性，在氧化环境下极易被氧化生成过氧化物，同时这些功能活性物可能遇到易降解的情况，都会导致其营养品质和感官特性下降；使得它们在生产、储存、运输、生物利用率和感官接受性等方面都存在着技术挑战。

脂质体是一种既可包载水溶性物质又可包载脂溶性物质，由磷脂双分子层构成的脂质囊泡。磷脂是形成脂质体的主要材料，它无毒、可生物降解且不刺激免疫系统；脂质体具有良好的溶解性、可控性、定向靶向释放、易渗透过膜等优点。脂质体用于包埋活性物材料，既能保护活性物远离易被破坏的环境条件，如氧化、pH 变化和酶降解，又可以促进活性物的生物利用度。本文以一种油状活性物A制备为例，一般制备步骤是将油状活性物A溶解在磷脂中，再加入水相，磷脂将自组装形成脂质双分子层将油状活性物A包埋在亲脂层中；磷脂、油状活性物A和水的混合物经过声处理形成胶囊型产品，较后经过冻干成粉末。将油状活性物A包埋在脂质体中在一定程度上减缓油状活性物A的氧化。

本文将简介以薄膜分散法-高压微射流纳米均质法制备油状活性物A纳米脂质体的方法于优化过程；以包封率和粒径为考察指标，通过单因素试验和正交实验，考察制备工艺对油状活性物A纳米脂质体的影响，并确定较好制备工艺条件。

核心实验设备：

RE-52AA 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂

NanoGenizer30K 微射流纳米高压均质机 微流纳米生物技术有限公司

NICOMP 380/ZLS 纳米粒度分析仪 美国 PSS 粒度分析仪公司

图 NanoGenizer微射流纳米高压均质机

实验流程：

称取一定量的卵磷脂、β-谷甾醇、吐温-80、油状活性物A于烧杯中，加入无水乙醇溶液，在 50℃水浴下溶解，待溶解完全后，在减压条件下旋转蒸发去除乙醇，在壁上形成一层薄膜。之后加入一定体积的磷酸盐缓冲液（PBS 溶液），低压下旋转洗膜得到粗脂质体。在将粗脂质体进行动态高压微射流处理，得到油状活性物A纳米脂质体。实验流程见图

图 油状活性物A纳米脂质体制备工艺流程图

油状活性物A纳米脂质体制备工艺的优化实验方法：

磷脂浓度对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂甾醇质量比为 6:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 20%，PBS 的 pH 值为 6.5，微射流压力为 120Mpa，微射流次数为 2 次不变，考察磷脂浓度为 5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

磷脂甾醇质量比对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 20%，PBS 的 pH 值为 6.5，微射流压力为 120Mpa，微射流次数为 2 次不变，考察磷脂甾醇质量比为 3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

磷脂油状活性物A质量比对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂甾醇质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 20%，PBS 的 pH 值为 6.5，微射流压力为 120Mpa，微射流次数为 2 次不变，考察磷脂油状活性物A质量比为 4:1、6:1、8:1、10:1、20:1 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

吐温用量对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂甾醇质量比为 6:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，PBS 的 pH 值为 6.5，微射流压力为 120Mpa，微射流次数为 2 次不变，考察吐温用量占磷脂的 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

PBS 的 pH 值对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂甾醇质量比为 6:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 15%，微射流压力为 120Mpa，微射流次数为 2 次不变，考察PBS 的 pH 值为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

微射流压力对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂甾醇质量比为 6:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 15%，PBS 的 pH 值为 7.5，微射流次数为 2 次不变，考察微射流压力为 0Mpa、30Mpa、60Mpa、90Mpa、120Mpa、150Mpa 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

微射流次数对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

固定磷脂浓度为 20mg/mL，磷脂甾醇质量比为 6:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的 15%，PBS 的 pH 值为 7.5，微射流压力为 90Mpa 不变，考察微射流次数为 1、2、3、4、5、6 条件下对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。

油状活性物A纳米脂质体制备配方和工艺单因素试验与结果：

磷脂浓度对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 磷脂浓度对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图结果可知，随着磷脂浓度的增加，油状活性物A纳米脂质体的包封率逐渐增加后趋于稳定，粒径逐渐变大。这是因为随着磷脂浓度的增大，卵磷脂的含量越多，有足够的量可以用来包埋油状活性物A，所以油状活性物A纳米脂质体包封率增大；然而继续增加磷脂浓度，脂质体囊泡已饱和，包封率已达到大至；此外，当磷脂浓度在30-50mg/mL 时，由于卵磷脂含量过多使得难以在壁上形成均一稳定的薄膜，水合时导致多余的磷脂析出，造成脂质体粒径的增大。综合考虑制备过程中膜的形成、包封率和粒径，较后选取 20-30mg/mL 作为较适磷脂浓度。

磷脂甾醇质量比对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 卵磷脂甾醇质量比对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图结果可得到，随着卵磷脂与 β-谷甾醇质量比的增加，油状活性物A纳米脂质体的包封率先增加后减小，粒径呈先减低后升高的趋势。只用磷脂作为壁材，形成的脂质体结构不是很稳定；添加一定量的甾醇物质可以提高其稳定性[133]。β-谷甾醇因为结构与胆固醇相似，同样可以加固脂质体双分子层，使得脂质体更加均匀、稳定。当随着 β-谷甾醇的添加量的增加时，β-谷甾醇与磷脂双分子膜之间的疏水作用力增强，使得磷脂分子结合得更牢固，包封率逐渐增大，粒径减小；然而，继续增加 β-谷甾醇含量，反而会破坏磷脂双分子层结构，导致包封率降低，粒径增大。综合考虑实验结果，把卵磷脂甾醇质量比为 8:1 作为较好比例

磷脂油状活性物A质量比对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 磷脂油状活性物A质量比对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图结果可以得到，油状活性物A纳米脂质体的包封率随着油状活性物A的添加量的增加而降低；粒径则相反，随着油状活性物A添加量的增加而增大。这是因为油状活性物A含量较少，则有足够的磷脂可以用于包载油状活性物A，包封率较高，粒径较小；若油状活性物A添加量过大，过磷脂的包载能力，导致形成的脂质体不稳定，包封率降低，粒径增大。虽然油状活性物A添加量越低，包封率越高，但是载量却减少，造成磷脂的浪费。考虑到油状活性物A的载量、包封率和粒径等因素，卵磷脂油状活性物A质量比为 6:1 为较好条件

吐温用量对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 吐温-80 含量对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图 可知，随着吐温-80 含量的增加包封率逐渐增加后降低。这是因为吐温-80 的添加可以协助 β-谷甾醇稳定磷脂双分子层的稳定性；吐温-80 过大时，反而会破坏脂质膜的结构，使得包封率降低。

PBS 溶液的 pH 值对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 PBS 的 pH 对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图可知，PBS 的 pH 值对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响不大。pH 值越低，会造成磷脂水解，而且水解产物会降低溶液体系的 pH，从而影响脂质体的稳定性。所以，选取 7.5 为较适 PBS 的 pH 值，在此条件下包封率大至。

微射流压力对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

薄膜分散法制备的脂质体大多为多层脂质体或多囊脂质体，粒径较大。研究人员常通过微射流纳米均质的方法来更控制脂质体的大小。

图 微射流压力对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响

由上图可知，随着微射流压力的增加，脂质体包封率逐渐增加后趋于稳定，粒径逐渐降低。这是因为多层脂质体或多囊脂质体经过微射流技术处理，形成单层脂质体，粒径降低，脂质体比表面积增大，使得包封率增加[131] 。粒径越小，溶液中粒子间的吸引力减少，溶液较稳定，加强生物活性化合物的生物利用率。但是，如果压力过大，可能会损坏磷脂双分子层的功能和结构。因此，考虑多方面因素，微射流压力选取 90MPa。

微射流次数对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

图 微射流次数对油状活性物A纳米脂质体的包封率和粒径的影响

由上图可知，随着微射流次数的增加包封率逐渐增加，后趋于稳定；粒径随微射流次数的增加逐渐降低。这可能是因为微射流次数越多，粒径越小，粒径的分布范围越均匀，包封率越大。因此，较后选取较好微射流次数为 3 次。

小结：

本实验采用薄膜分散法-DHPM 制备淡水油状活性物A多不饱和脂肪酸纳米脂质体，考察磷脂浓度、磷脂甾醇质量比、磷脂油状活性物A质量比、吐温用量、PBS 的 pH 值、微射流压力和微射流次数对油状活性物A纳米脂质体包封率和粒径的影响。通过极差分析，选取磷脂浓度、磷脂甾醇质量比、吐温用量和微射流压力这四个影响较大的因素为中心点，设计四因素三水平正交试验，确定较优制备工艺参数。正交实验结果显示：较好制备油状活性物A纳米脂质体的工艺参数为：磷脂浓度为25mg/mL，磷脂甾醇质量比为 7:1，磷脂油状活性物A质量比为 6:1，吐温用量占磷脂的12.5%，PBS 的 pH 为 7.5，微射流压力为 120MPa，微射流次数为 3 次。在较好制备工艺条件下，油状活性物A纳米脂质体的包封率达到 94.05%，粒径为 88.9nm。

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