研究简介：
脂质体制备面临的一个主要挑战是制造过程中使用的大量有机溶剂。本文实现了一种载药脂质体的无溶剂生产方法，并证明了其在水核和双层载药中的适用性。方法采用高剪切将磷脂与水缓冲液混合，然后使用微射流高压纳米均质机将脂质体粒径减小。脂质体通过切向流过滤纯化，并根据大小、多分散性指数、zeta电位和载药量进行了表征。
本研究介绍了含阿霉素的聚乙二醇化脂质体可以用这种无溶剂的方法制造，粒径为100-110nm，低多分散性指数(PDI＜0.2)和高载药量（97-98%）。如果需要，脂质体可以通过微射流处理进一步缩小尺寸，而不影响载药量。用非聚乙二醇化脂质体也得到了类似的结果。使用双层负载两性霉素B脂质体，同样可以在临床适当的大小范围内(100-110nm大小，低PDI)和高载药量（98-100%）。
背景：
脂质体由于能够通过靶向提高药物疗效，已被广泛用于疏水和亲水药物的传递研究。在美国和欧盟，脂质体批准的数量（表1）继续增长。此外，随着许多与脂质体产品相关的专利即将到期，已批准的非专利脂质体产品的数量迅速增加。表2总结了较成功和较成熟的产品的增加，如Caelyx/Doxil（聚乙二醇脂质体阿霉素）和AmBisome(脂质体两性霉素B)。
表1 已上市的脂质体产品，首次批准和预期的专利到期日期
表2 非专利的阿霉素和两性霉素B脂质体产品及其制造商
在脂质体的生产中，无论是在工作规模还是在大规模生产中，都通常使用有机溶剂，例子如表3所示。
表3 脂质体制造过程中所用的方法和溶剂
在实验规模上，薄膜水化法仍然是制造脂质体较广泛采用的方法，它是基于脂质与药物（或空白脂质体先制备）成分在有机溶剂中的溶解。溶剂随后通过旋转蒸仪蒸发，然后使用水溶液缓冲液水化膜。其他生产脂质体的方法包括逆向蒸发和乙醇注入法。当考虑溶剂的选择，安全处理，去除和处置是一个关键的考虑有机溶剂可以与慢性健康影响，特别是卤化溶剂和大至允许浓度限制溶剂配方由国际协调技术要求委员会为人类使用药物（ICH）指导方针。溶剂根据ICHQ3C指南分为四类。前列类溶剂被称为人类致癌物，并被怀疑对环境有害。第二类溶剂（氯仿和甲醇）应受到限制，因为它们可能是不可逆毒性的诱因。氯仿和甲醇的可接受浓度限值分别为60和3000ppm，暴露限值分别为0.6和30 mg/day。乙醇是第3类的浓度限值为5000 ppm。考虑到这些问题，各种方法报告了使用危险度较低的溶剂，如异丙醇和乙醇。
考虑到这些问题以及开发更可持续的生产实践的必要性，我们研究并开发了一种易于采用的不需要使用有机溶剂的药载脂质体制造方法（图1）。脂质体大小控制采用电动台式实验室M110P微射流高压纳米均质机。利用这种无溶剂和可扩展的过程，我们制造了阿霉素载脂质体（聚乙二醇化和非聚乙二醇化）和两性霉素b载脂质体的物理化学属性在大小和载药方面映射到临床批准的产品。
图 1 无溶剂脂质体制造、缓冲液交换/纯化、载药和灭菌的示意图
脂质体是将固体脂质添加到不含有机溶剂（1）的水缓冲液中，使用微射流高压均质(M110P微射流纳米均质机)（2）处理，并进行切向流过滤进行缓冲液交换和纯化（3），较后，载药脂质体使用0.22µm过滤器进行无菌过滤（4）。
主要实验方法：
阿霉素脂质体的无溶剂制造
空白聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂质体(HSPC：Chol：DSPE-PEG2000 56 ：38：5和鸡蛋PC：Chol 45：55摩尔比)通过将固体脂质和胆固醇与100 mL水化缓冲液混合，如表4所示。脂质分散采用高剪切混合(高剪切混合器IKA T25剪切机配备S25N-18G剪切头)，在8000 rpm下，在70°C下分散1h。使用M110P微射流均质机或者NanoGenizer微射流均质机，在65-70°C下缩小脂质体的尺寸。水在高于热交换器中磷脂转变温度(70°C)的温度下循环，以实现脂质体双层的必要流动性，有利于减小颗粒径。M110P微射流均质机先用缓冲液起始，样品在5000psi、8000psi、15 000 psi、18 000 psi和20 000 psi的压力下进行处理，较多进行三次处理。对配方进行切向流过滤(TFF)，以进行缓冲液交换和浓度控制（图1）。随后将阿霉素加入脂质体中，在60°C下孵育10 min，使用pH梯度主动加载药物。
表4 制造过程中使用的含阿霉素的处方
载药量定量
阿霉素的定量采用680型(Bio-Rad实验室。测量490nm处的紫外吸收度。脂质体用50%2-普萘洛尔（v/v）溶解。校准曲线是在与样品相同的条件下进行。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.05和0.15mg/mL。两性霉素B的定量分析结果为采用反相高效液相色谱(HPLC)（安捷伦1100），使用连接到仪器的紫外-可见检测器进行。采用双子座C18柱，110，孔径150 9 4.60 mm5lm（酚烯，麦克莱斯菲尔德，英国）作为固定相。1 mL/min流速，洗脱梯度18 min，由溶剂A（0.1%高氯酸水）和溶剂B（100%乙腈）组成，在408nm。较初，梯度在5 min时从95：5(A：B)增加到5：95(A：B)，然后在15 min时恢复到初始成分95：5(A：B)，并保持2 min，直到分析结束。样品进样量为20µL。LOD和LOQ分别为0.09和0.28µg/mL。
通过冷冻技术检测脂质体的形态学特征
将5µL的脂质体放置在400目的乳汁碳涂层网格上，使用单面印迹2秒，然后立即将样品网格浸入氮冷却的乙烷（100%乙烷）中，制备显微镜下的样品。然后使用Jeol Jem F-200显微镜(Joel，东京，日本)在液氮温度和200 kV下观察脂质体的形态。
主要实验结果
无溶剂法可产生尺寸可控的高载药脂质体
为了研究制造过程中压力和均质通道数的影响，在8 mg/mL脂质浓度下，使用有机无溶剂技术制备了聚乙二醇化脂质体（见表4）。在脂质初始水化和产生多层囊泡后，脂质体的平均粒径约为1500nm，D90约为2600nm（图2）。然后使用M110P微流化器处理器将脂质体的尺寸缩小到15 000、18 000和20 000 psi，较多有三个均质通道。图2显示了压力和通过次数在制造过程中采用显著控制脂质体大小和PDI。在15 000 psi下生产的配方显著降低(P＜0.05）平均粒径到100nm左右，PDI 0.29。D50的大小与平均粒径相似，D90约为200nm（图2）。为了增强尺寸缩小，采用了更高的压力（图2）；在18 000 psi时，脂质体的尺寸显著减小，1次后至120 nm，通过3次（0.19 PDI）至95 nm（z-平均直径），D10、D50和D90也对应减小（图2）。进一步将压力增加到20 000 psi，产生了较快速的尺寸减小，而小至的粒子只需要两次处理就可以达到小于100nm的平均粒径，而且PDI小于0.2。在所有配方中，zeta电位在5与-5 mV的范围内，对所使用的压力没有显著影响。一般来说，压力是影响物理化特性的大至参数，三种压力的值明显不同。前列次通过后，通过的次数增加对脂质体粒径的大小没有显著影响。然而，这里受影响的主要脂质体特征是PDI。在第二次通过后，当压力分别为18 000和20 000 psi时，PDI达到了0.2左右的平台期（图2）。
图 2 微射流压力和处理数对聚乙二醇化脂质体配方的影响
为了进一步探索这一点，我们在18 000和20 000 psi下生产了聚乙二醇化脂质体配方，并使用TFF将外部缓冲液从250 mM硫酸铵(pH 5.5)交换为蔗糖组氨酸，建立了pH梯度。然后将阿霉素装入这些配方中，较后，对这些配方进行消毒(0.22µm过滤)（图3）。在18 000 psi条件下生产后的粒径(z-平均直径)约为。两次通过后为105 nm，三次通过后下降到95 nm。在20 000 psi时，经过第2次和第3次后，尺寸分别下降了约10 nm到95和85nm（图3）。在所有四个测试参数中，脂质体的PDI仍然较低显示出高度的同质性。这些配方仍然在硫酸铵缓冲液中，不含载药，zeta电位是中性的（图3）。然后对脂质体进行缓冲液交换（使用组氨酸-蔗糖缓冲液），建立pH梯度。这并没有显著改变各种脂质体的颗粒大小，但有显著的改变将所有四种制剂的zeta电位降低到35-40 mV。利用建立的pH梯度，脂质体主动装载阿霉素。载药量的>值为90%，无论配方中使用的压力或路数如何（图3），而随后的灭菌对这些属性没有显著影响。
图 3 微射流压力和处理数对聚乙二醇化脂质体配方的影响：粒径、PDI和载药量。
将无溶剂法制备的脂质体与传统方法制备的脂质体进行了比较，脂质水化和声处理方法（图4）。这些脂质体以HSPC或DSPC作为基脂质制备。采用脂质水化法，z-平均直径约为100~120nm，PDI＜0.2，包封率（90%）。冷冻电镜显示了经典的椭圆形/椭球形脂质体，这是在水相中形成的长纳米晶体的结果。当这些配方采用无溶剂法制备时，无论使用的碱性脂质类型如何，都可以看到类似的脂质体形态（图4）。
图 4 聚乙二醇化阿霉素负载脂质体的理化特征和形态学研究。
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