从局部滴注眼药水到眼后段一直是眼部药物开发的大至挑战之一。我们开发了利用微射流高压均质机（或叫微流化器）制备脂质体的方法，以实现可调节的纳米颗粒大小（甚至小于80 nm）和质粒DNA的高负载能力。微射流均质处理过程参数显示会影响脂质体的大小。较高的工作压力和通过微射流高压均质机至少10次产生了狭窄尺寸分布的小脂质体。在+4℃下，脂质体物理稳定几个月。用组织标本共聚焦显微镜研究了优化脂质体配方在大鼠眼中的体内分布。转铁蛋白被用作靶向视网膜色素上皮的靶向配体。脂质体在不同后段组织中的大小依赖性分布。直径小于80 nm的脂质体渗透到视网膜色素上皮中，而直径大于或等于100 nm的脂质体分布在脉络膜内皮中。主动靶向被证明是脂质体保留到目标组织的必要条件。总之，这种微射流高压均质机在滴眼液中产生的小脂质体是将药物传递到眼睛后段组织的一个有吸引力的选择。

研究背景：

眼睛的后段仍然是药物传递的一个困难的目标。使用局部滴眼液只能相对容易地治疗眼睛的前部。到目前为止，较常见的给药方法是直接注射到玻璃体腔内。玻璃体内注射必须由医疗专业人员使用，需要频繁给药，这种药物管理是患者和卫生保健系统的负担。例如，渗出性的老年性黄斑变性（AMD）在患者的余生中每月通过双侧玻璃体内注射抗体进行治疗。由于重复使用侵入性注射涉及感染和其他眼部并发症的风险，在大患者群体中每次注射都要进行广谱抗生素治疗，这一过程可能导致耐药菌株的进化。每月给药方案是可行的，抗体通常有半衰期在玻璃体中约一周，但仍然不能实现方便和对医疗专业人员的不依赖。此外，该方法不适用于玻璃体中典型半衰期为1-10小时的小分子量药物。对于小分子，可以使用缓慢溶解的悬浮液或复杂的控释植入物，但药物传递的侵入性和许多相关问题无法避免。因此，控释植入物在临床上的应用并不广泛。非侵入性给药方法，将大大改善视网膜疾病的管理，如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜斑水肿和视网膜细胞凋亡。

眼表滴眼液迅速清除，角膜上皮阻碍药物进入内眼。经典的药物进入眼睛的经角膜途径只适用于亲脂性小分子，因为它由一个细胞紧密排列的亲脂性层和两个亲水层组成。与角膜相比，结膜的通透性更高，也更容易适应大分子。此外，非角膜途径在大分子传递方面比小分子更有利于传递，因为它们对体血循环的损失较少。然而，通过非角膜途径输送药物进入眼后段是一个复杂的过程，涉及组织屏障（结膜、巩膜、视网膜色素上皮）和液体流动因子，如结膜和脉络膜消除到血流。这将后段生物利用度小分子量药物，如噻莫洛尔降低至0.01%。结膜毛细血管被开窗，从上皮细胞转移到血管对大分子和纳米颗粒几乎没有屏障。血液循环将药物分布在眼睛周围，从而帮助递送过程。结膜动脉和睫状动脉指向眼的后段，进一步分布到毛绒膜。视网膜色素上皮下的毛细血管密集有小孔孔。孔隙直径只有75-85纳米，这可能限制通过颗粒的大小。

自Bangham的关键研究（Bangham et al.，1965）以来，脂质体已经在药物传递中进行了研究。他们也被研究用于局部眼部和玻璃体内给药。局部给药后后段给药是眼部脂质体给药的大至挑战和机会。研究表明，脂质体药物在玻璃体内注射后可到达脉络膜、RPE和视网膜神经节细胞，在局部滴药后可分别到达神经视网膜和神经节细胞。较近，纳米级脂质乳剂也被用于局部药物传递系统到视网膜。然而，到RPE的输送和从眼睛表面到背部的运输路线仍有待研究。脂质体类型之间的传递也有很大差异。脂质体配方变量可用于调节对眼部组织的输送特性。脂质体不太可能渗透到紧密的角膜屏障中。结膜和将是更有可能的渗透途径。对于直径达5.5 nm的颗粒，任何颗粒大于膜的颗粒都可以通过内吞途径携带。结膜可以吸收直径为300纳米的纳米颗粒，体外已经显示脂质体通过结膜的渗透。药物通过结膜后，可通过巩膜和玻璃体扩散到达眼睛后部，或更直接地通过血液循环到达脉络膜。只有当脂质体能够分布到眼部组织时，才能实现血管介导的脂质体传递到后节段。为此目的，由于脉络膜和结膜开窗的大小有限，脂质体的大小至关重要。

为了实现较小的脂质体尺寸，我们开发了利用微射流均质处理仪的方法。该装置驱动高压（甚至30,000 psi)的液体通过相互作用室。然后，通过微射流高压均质机收集或重新循环该液体。当相反方向的高速流体流合并时，由于室壁（Z型室）的剪切力或剪切力和颗粒碰撞（Y型室）。微射流高压均质机已被用于处理乳剂(Mahdi Jafari et al., 2006）、聚合物颗粒（(Bodmeier and Huagang, 1990; Sani et al., 2009）、纳米晶（(Siqueira et al., 2009）和脂质体（(Takahashi et al., 2009; Thompson and Singh, 2006）。作为一种生产脂质体的方法，微射流均质处理具有低多分散性（Mahdi Jafari et al.，2006），溶液的连续处理，适合热敏感药物，并易于扩大到更大生产规模的体积（Sorgi和Huang，1996）。较终粒径取决于主要工艺参数，如压力、温度和通过微射流高压均质机的时间（(Mayhew et al., 1984; Saheki et al.,2012; Thompson and Singh, 2006; Washington and Davis, 1988）。

实验设备：

微射流高压均质机（使用Y与Z型金刚石交互容腔）

图 微射流高压均质机结构示意图

图 Y型与Z型微射流金刚石交互容腔

部分实验方法与结果：

1 使用薄膜蒸发法制备磷脂膜，用15 ml纯水水合，在65 C水浴中浸泡30 min，在转相温度下加热30 min，然后用UC-1331声仪声5 min，形成大脂质体。

2 具有大脂质体的样品用实验型微射流高压均质机（装Y型金刚石交互容腔）或（装配Z型金刚石交互容腔）进行处理.温度高于磷脂转变温度（65C）的水在热交换器中循环，以实现脂质体双分子层的必要流动性。微射流高压均质机用水启动，样品在5000 psi（345 bar）、10000psi（689bar）和20000psi（1379bar）的压力下进行处理，通过时间从1到20。在实验型型微射流高压均质机的情况下，产品入口储层的含量与流出微射流高压均质机的产品流出流混合。使用配备鲁尔注射器的实验型微射流高压均质机，样品通过分离填充的流出注射器，包括加工过的产品，并将注射器连接到入口阀门进行下一个工艺循环。将一个新的无菌注射器连接到流出阀上，以便样品在下一次通过时离开微射流高压均质机。

图 2 A 不同微射流压力与次数对脂质体粒径影响 2B 不同腔体类型对脂质体粒径影响 2C 不同腔体类型制备的脂质体稳定性测试

3 微射流高压均质机工艺参数对粒径的影响

采用薄膜水化法制备了大批量脂质体。脂质体的直径从2290nm~3523nm不等，标准差（sd）为434~1212nm。大脂质体在5000 psi、10000psi和20000psi的压力下用微射流高压均质机进行处理。脂质体溶液通过微射流高压均质机1、3、10、15和20次后采集样品，用动态光散射分析脂质体直径（图2A）。

通过微射流高压均质机的前列次处理对脂质体大小的影响较为显著。使用所有压力后，直径减小到亚微米尺寸。通过微射流高压均质机3次后，20000psi样品的直径已经在94 ± 64 nm，而10000psi和5000 psi样品的直径分别为136 ± 98 nm和470 ± 452 nm。可以看出，标准差仍然很大。继续微射流均质处理到10次仍然对5000 psi产生的脂质体的大小有显著影响，这也通过较小的标准差表明降低了颗粒的多分散性。例如，脂质体在微射流处理前的平均尺寸为2290 ± 1212 nm，2000psi 处理1次后229±295nm，3次后94±64nm，10次49±9nm，15次1 ± 3 nm和20次53 ± 3 nm。在高工作压力下通过微射流高压均质机约10次后，没有观察到脂质体大小的变化。使用5000 psi的压力，尺寸随处理次数增加以稳定的速度减小。结果清楚地表明，脂质体大小的减小与压力和处理次数的增加成正比。值得注意的是，这可能不是对所有的纳米颗粒都适用的。例如，使用聚乙二醇聚乳酸-共乙二酯（PEG-PLGA）聚合物胶束会导致粒径的增加。

通过改变工艺参数，可以产生不同大小的脂质体。因此，这种方法为考虑粒子的直径是一个关键因素的研究提供了一个有用的工具。用110P型微射流高压均质机在20000psi压力和10次处理下生产的脂质体具有合适的直径来满足我们对视网膜靶向的要求。因此，我们选择了这些工艺参数来进行进一步的研究。

To be continued

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