结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)经呼吸道感染引起的慢性传染病，是仅次于新型冠状肺炎的第二大单一致死性传染病。亚单位疫苗安全性好、免疫原性强，能够提供抗细菌感染的特异性免疫保护。因此，研发安全、有效的Mtb亚单位疫苗是TB研究的重要内容之一。

脂质体纳米颗粒(lipidnanoparticles,LNP)是一类具有一层或多层同心脂质双分子层结构的疫苗佐剂或递送系统，因生物相容性好、生物利用度高等优点已用于如新冠肺炎、癌症等重要疾病的防治。本研究拟构建包裹抗原蛋白EsxV和黏膜佐剂分子c-di-AMP的LNP亚单位疫苗(EsxV:c-di-AMP:LNP,EsxV:C:L)。

图1 文章首页

称取20mg胆固醇加入20mL无水乙醇，在50摄氏度水浴下充分溶解，再加入120mg大豆卵磷脂充分溶解；上述混合溶液于圆底烧瓶中在50-60rpm、50摄氏度条件下减压旋转蒸发除去乙醇，直至形成无色透明的脂膜。随后加入60ML pH7.0的磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffersolution,PBS)，同时加入0.0048g的DSPE-PEG2000，在52摄氏度水浴常压条件下旋转圆底烧瓶使脂膜水化溶解，继续50摄氏度水浴2h，形成多室脂质体。冰水浴中超声10min，条件设置为：超声5s、间歇5s、功率200W。超声结束后，50摄氏度水浴1h，即获得单室脂质体。向单室脂质体中加入500μg EsxV抗原和167μg c-di-AMP，再次以同样条件超声，即获得EsxV:C:L。同时,按照上述条件制备不含EsxV和c-di-AMP的空白LNP，4摄氏度保存备用。

图2 LNP透射电镜观察

图3 LNP粒径分布

图4 LNP PDI值

图5 LNP Zeta电势

结果发现，空白LNP基本呈球状，大小均一(图2A)；包裹EsxV和佐剂c-di-AMP的LNP形态未发生明显变化(图2B)，且和粒径大小、PDI检测结果均相符。以上提示EsxV:C:L LNP和空白LNP形态稳定、分布均一，可用于后期免疫学特性研究。

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