构建黏膜防御对传染性疾病的预防极为重要，因为像流感病毒等大多数病原体会经黏膜部位入侵机体。同时，经黏膜部位接种疫苗不仅可以诱导系统免疫应答，还可以在黏膜部位建立有效的免疫保护。

纳米乳（nanoemulsion,NE）是一种应用广泛的疫苗递送载体。但传统的纳米乳通常为电负性，且本身不具备黏膜黏附性，在鼻腔免疫中不能有效地发挥免疫诱导作用。

本研究尝试在纳米乳表面包裹正电性的壳聚糖（chitosan,CS），以鸡卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）为模型抗原，制备成新型的阳离子纳米乳疫苗递送载体。CS具有较好的生物黏附性，可以延长制剂在鼻腔的滞留时间，进而提高上皮细胞和APCs对抗原的摄取。

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包载抗原的纳米乳（NE-OVA）的制备

称取500mg角鲨烯和200mg司盘85混合均匀为油相，再称取200mg吐温80溶解于10mL注射用水，涡旋下加入油相中，得到初乳。将初乳进行高压均质（100000kPa，5min），定容至40mL。称取5mgDSPE-PEG2000溶解于1mL制得乳剂中，加入62.5μL十二水合硫酸铝溶液（125mg/mL），再加入HEPES缓冲液（pH8.0）调至中性，即得NE。取NE与OVA混匀（OVA质量浓度为0.25mg/mL），于37摄氏度摇床中孵育30min即得NE-OVA。

CS修饰的NE-OVA的制备

称取适量CS溶解于0.3%冰醋酸中，制成质量浓度为3mg/mL的CS储备液。向1mL制备好的NE中加入pH值为8.0的HEPES缓冲液0.60mL ，涡旋下滴加0.87mL质量浓度为1mg/mL的OVA溶液，于37摄氏度摇床中孵育30min。涡旋条件下加入1mLCS溶液，即得制剂（CS-NE-OVA）。制剂中CS的质量浓度为0.86mg/mL，OVA质量浓度为0.25mg/mL。

图2 NE-OVA（A）和CS-NE-OVA（B）的透射电镜图

通过透射电镜观察NE的形态，NE-OVA和CS-NE-OVA均显示为较均一的类球形形态。NE-OVA的平均粒径显示为（130.4±1.93）nm，电位为（−20.1±2.50）mV，PDI为0.16±0.03。与此同时，CS-NE-OVA经检测后显示平均粒径为（167.2±0.75）nm，平均电位为（13.7±0.85）mV，PDI为0.21±0.01。PDI均小于0.3，表现出较好的分散性。

图3 CS-NE-OVA在鼻腔滞留情况

在15～60min内，CS-NE-OVA组鼻腔部位的荧光明显强于OVA组和NE-OVA组。OVA组和NE-OVA组在给药后15min时，荧光强度显著降低，表明其在鼻腔中被快速清除。而CS-NE-OVA组在60min时，仍然保留较强的荧光强度，表明仍有较多CS-NE-OVA滞留于鼻腔部位，显示了较好的滞留效果。

研究验证了该阳离子纳米乳疫苗递送系统诱导抗原特异性的系统和黏膜免疫应答的能力。相信在鼻腔接种疫苗将是极具有前景的给药方式！

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