苏州微流纳米生物技术有限公司

Suzhou Will NanoBioTech Co.,Ltd.
咨询热线: 13020218906  邮箱: biotech@willnano.com
资讯动态 首页 > 资讯中心 > 公司新闻

应用高压微流化器制备纳米乳佐剂(MF59微射流制备)

作者:www.willnano.com 日期:2021-12-13 点击:1096
一键分享

MF59佐剂已经成功应用于多种人用病毒疫苗(包括作为流感疫苗的佐剂),这种纳米乳剂型的佐剂的微流化制备,受到越来越多前沿领域工作者的关注。本文将简介疫苗佐剂的概念、常见佐剂类型以及MF59佐剂的制备过程与结果。

佐剂广泛应用于多种疫苗,能够增强机体对抗原的免疫应答反应,显著提升疫苗作用效果。作为一种免疫增强剂,佐剂不仅可以减少疫苗中抗原的使用量,同时还能迅速激活免疫系统,持别对老年及儿童等免疫力低下人群意义重大。虽然铝佐剂作为经典代表性佐剂在临床应用己近百年,新型佐剂的开发和研究却是刚刚兴起,并逐渐成为当今疫苗研巧中的重要领域。新型佐剂较经典铝佐剂具有更为强烈的免疫激活作用,然而这种免疫活性的放大效应是否会扰乱机体的正常免疫系统功能尚未明确。

现在已上市的人用佐剂寥寥无几,除传统铝佐剂外,欧洲己批准水包油乳剂MF59和AS03 (adjuvant system03)用于流感疫苗;在美国和欧洲,AS04(adjuvant system 04)己用于HBV和HPV。随着近年来人们对免疫系统研宛的不断深入,Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)作为佐剂潜在的新现点备受瞩目,一些TLR依赖性佐剂不断涌现:如TLR3激动剂聚肌胞(Poly(I:C));AS04中的TLR4激动剂单磷脂酸(Monophosphory Lipid A,MPL);TLR5激动剂鞭毛蛋白;TLR7和TLR8激动剂为富含鸟嘌呤和尿嘧啶的ssRNA;TLR9激动剂含有CpG基序的dsDNA胞嘧啶磷酸鸟嘌呤寡聚脱氧核酷核酸(CpG-ODN)等。

不同类型佐剂简述:

1. 铝佐剂

在不溶性盐类胶体佐剂中,铝佐剂是最常用的佐剂之一。在乙肝病毒(HBV)和人类乳头状瘤病毒(HPV)的重组蛋白疫苗中仅用明矾作为佐剂即可诱导保护性免疫反应,而 HIV 疫苗不仅需要有效持久的免疫反应,还需要 T 细胞的特异性反应,而铝佐剂在 HIV 疫苗的应用中作用效果较差。铝盐佐剂在许多人类疫苗应用中获得批准,包括白喉百日咳破伤风(DPT)疫苗、嗜血杆菌流感疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、甲肝疫苗、肺炎链球菌疫苗、脑膜炎双球菌疫苗和人乳头状瘤病毒疫苗。铝佐剂的作用机制主要为可与抗原形成复合体,该复合体为抗原贮存库,其稳定的程度决定了抗原的释放速度,可以慢慢释放抗原,延长抗原的作用时间。这种微粒结构可以提高 APC如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞吞噬抗原的能力,并可增加 MHC-Ⅱ类分子的表达和抗原的提呈。最近的研究证明铝佐剂可以诱导单核细胞和巨噬细胞趋化因子的分泌,在铝佐剂的注射位置可以促进炎性单核细胞的聚集并迁移到淋巴结中,进一步分化为炎性树突状细胞。铝佐剂通常刺激产生 Th2 型免疫反应而不是显著的T细胞反应。铝佐剂的优势主要为具有较高的安全性,增强刺激抗体的反应效果较好(更快、更高的抗体滴度,更长时间的免疫反应),抗原相对稳定,对于大规模生产应用配方简单。铝佐剂还可以引起注射部位的局部肉芽肿,若频繁的加强免疫则需要注意这一特性。

2. 纳米乳佐剂

纳米乳状液的两种基本类型是 O/W(水包油)和 W/O(油包水),近年来人们也逐渐研究出几种多重乳状液,它主要为两种基本类型乳化剂的混合体,如 W/O/W 或 O/W/O。新型油包水乳剂 Montanide ISA 是一系列油佐剂,它能够用于配制不同类型的乳化剂,如 O/W、W/O 或 W/O/W。这种佐剂主要基于矿物油、非矿物油及两者混合配制,也有基于甘露醇的特异性表面化学物质。其中 MontanideISA50 的表面活佐剂为二缩甘露醇油酸酯,该佐剂对抗体产生的影响与非完全弗氏佐剂的作用效果类似,但很少引起炎症反应。油性佐剂 Montanide 在前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌疫苗的临床试验中广泛应用。古巴肺癌疫苗 CIMAvax EGF 就是使用 Montanide ISA 51 进行乳化的,已在拉丁美洲进行临床Ⅲ期试验。MF59 是一种包含 1%鲨烯、0.5%三油酸聚山梨脂和0.5%Tween80 的 O/W 乳化剂,通过 Th2 反应途径刺激体液免疫反应。目前被用于诺华公司研制的一种命名为复立达的流感疫苗中,该疫苗是第一个在欧洲被批准添加 MF59的疫苗。Surender Khurana 等人在某种禽流感疫苗中加或没加 MF59 佐剂免疫实验动物,从实验结果中发现将佐剂与疫苗联合应用可在机体内产生相关抗体,该抗体能够识别更为广泛的不同类别的流感抗原,如某些已知的可灭活禽流感病毒的抗体。这项实验证实了 MF59 可增加抗禽流感病毒的抗体水平,同时也增加多种抗体类型,推测这些多样化的抗体可能对不同类型的流感病毒产生更为广泛的保护作用。

3. 脂质体和类病毒体

脂质体是传统佐剂的第三大类型,是由单层或多层膜样结构形成的脂质小囊,它能将抗原包裹起来充当抗原传递载体的功能。其效应明显优于铝佐剂,而且毒副作用低,具有良好的安全性,在部分人体试验中也已得到证实。虽然脂质体并没批准在疫苗中应用,但是与脂质体成分相似的类病毒体(由流感病毒的包膜蛋白组成)得到了批准应用。它还添加了一种功能性病毒包膜糖蛋白成分,能够辅助细胞的摄取和传递抗原到靶细胞中促进膜融合。获得应用类病毒体批准的疫苗包括 Epaxal™(甲肝灭活疫苗),Inflexal™ V(流感病毒疫苗),这两种疫苗在成人及儿童体内均可产生较高的免疫原性并具有卓越的耐受性。对于季节性流感疫苗,加佐剂的疫苗的免疫原性与不加佐剂的疫苗相比并没有明显的提高。在一项研究中发现,在早期,Inflexal™与加 MF59 佐剂的流感疫苗相比具有相似的免疫原性。在另一项研究中发现,对于年龄 60 岁及以上的受试者,不加佐剂的一种去活化及纯化分离的流行性感冒疫苗Fluarix™与添加MF59佐剂的亚单位疫苗Fluad™或者类病毒体的亚单位疫苗Inflexal™ V 具有相似的免疫原性。

4. Toll 样受体激动剂

Toll 样受体(TLRs)在免疫系统中识别病原相关分子模式,为一种病原识别受体。TLRs 的发现和与先天性及获得性免疫系统关系的认识为新型免疫佐剂和免疫增强剂的发展奠定了基础。免疫增强剂主要通过直接刺激固有免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞来发挥佐剂的功能。单磷酸脂质 A(MPL),TLR4 激动剂是一种领先的疫苗免疫刺激剂之一。MPL 是一种明尼苏达沙门菌 Re595 的脂多糖,通过去掉了脂质A 中的磷酸盐和脂肪酸基团解毒,但仍然具有结合 TLR4 的能力,与脂多糖相同的机制作用于固有免疫细胞。它还能刺激协同刺激分子的表达和细胞因子的释放,因此可以提高细胞和体液免疫水平。其他的 TLR 受体激动剂有免疫刺激序列(ISS)和微生物 DNA。ISS 被 TLRs 识别后,在固有免疫反应之后紧随的获得性免疫反应显著增强。一些 ISS 具有独特的生物学活性,临床试验证明应用 ISS 可以明显增强针对疫苗抗原的体液和细胞免疫反应水平。这种作用体现在不同传染病的候选疫苗中,如 B 型肝炎、疟疾、人乳头瘤状病毒和艾滋病疫苗。CpG ODN 是 TLR9 的激动剂,能够诱导前炎症因子如 TNF-α、 IL-1、 IL-6、IFN-α 和 IFNγ 的分泌,目前也作为免疫刺激序列用于肿瘤的治疗。在临床前研究发现 CpGs 具有诱导 Th1 免疫反应和细胞毒性 T 淋巴细胞反应的能力。到目前为止,有研究发现,ISS 复合体具有很好的耐受性,更深入的相关研究正在进行中。咪唑并喹啉胺也是一种候选佐剂,能够与 TLR7 和 TLR8结合。这种有机复合体具有较强的抗病毒活性,可以模拟自然的 TLR 受体配体。有研究证实对于 HIV 感染的小鼠模型,它可提高 T 细胞免疫反应和增强抗病毒的免疫反应。对于在人类的应用还需要进一步研究,可能首先会在癌症疫苗中尝试。

5. 皂苷

皂苷为一种来源于植物的佐剂。皂甙 Quil A 及其单体成分是南美奎拉雅属皂树皮提取物,它最早在兽用疫苗中应用,在人类中并没有应用。Quil A 提取纯化物 QS21在动物实验中证实能够加强 APC 的抗原提呈能力,诱导 CTL 反应以及 Th1 和 Th2 型免疫反应。QS21 良好的耐受性被认为可在人类的候选疫苗中应用。有实验证实 MPL与 QS21 具有良好的协同作用。

6. 免疫刺激复合物

免疫刺激复合物(ISCOMs)是一种作为抗原传递系统的佐剂,它是由脂类、胆固醇、抗原及糖苷 Quil-A 组成的笼状结构,可通过表面疏水作用捕获蛋白抗原,通过内吞作用被 APC 摄取。在动物实验中,ISCOM 已经成功的诱导了高滴度的抗体反应和辅助性 T 细胞和 CTL 反应。ISCOMATRIX 与 ISCOM 具有相似的结构,但是ISCOMATRIX 并没有渗入抗原,而是将抗原与 ISCOMATRIX 相连接构成疫苗的。由于其不限制疏水膜蛋白的应用,所以应用范围更广泛,并且生产工艺简便。皂角苷的免疫调节作用与抗原提呈的 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ分子途径相结合产生更广泛的免疫反应。ISCOMATRIX 佐剂的前景在于其适宜大的生产规模,持久稳定性以及诱导体液免疫的速度快。在很多实验中显示该佐剂在疫苗应用中具有高度的安全性和显著提高免疫原性,目前正在尝试将 ISCOMATRIX 佐剂用于丙肝、流感以及肿瘤疫苗中。

 

MF59佐剂微流化器制备过程与结果简介:

1. 样品两相配置

2. 初乳高剪切制备

3. 微射流高压纳米化

粒径控制、与标准品粒径对照、过0.22um滤膜

图 初乳制备

图  MF59纳米乳佐剂初乳制备


制备MF59纳米乳佐剂用高压微流化器

图 制备MF59纳米乳佐剂用高压微流化器


图 MF59佐剂微流化器制备前后

图 MF59佐剂微流化器制备前后(稀释对比外观)

 

实验小结:

经现场测试,初次尝试获得较好制备结果。样品在粗乳制备后呈现3峰且粒径较大,微流化处理后3次便获得和标准对照品相近的粒径与分布状态,而且产品经过0.22um滤膜高效快速,第一次测试处理,产品粒径、均一性以及大颗粒状态均满足要求。



微流纳米Vic